- Se Casó en primeras nupcias con su prima hermana María Manuela de Portugal (1527-1545) el 15 de noviembre de 1543. Tuvieron un único hijo:
- Carlos de Austria (1545 - 1568), Príncipe de Asturias. Se Casó en segundas nupcias con su tía María I de Inglaterra (1516-1558), en Winchester el 25 de julio de 1554. No tuvieron hijos. Su tercer matrimonio con Isabel de Valois (1545-1568) tuvo lugar el 22 de junio de 1559. Tuvieron dos hijas:
- Isabel Clara Eugenia (1566 – 1633), casada con su primo hermano, el Archiduque Alberto de Austria.
- Catalina Micaela (1567 – 1597), casada con Carlos Manuel I, Duque de Saboya. Se Casó en cuartas nupcias con Ana de Austria (1549-1580), el 12 de noviembre de 1570. Era hija de su primo Maximiliano II. Tuvieron cuatro hijos y una hija:
- Fernando (4 de diciembre de 1571 –1578), Príncipe de Asturias.
- Carlos Lorenzo (12 de agosto de 1573 – 30 de junio de 1575).
- Diego Félix (15 de agosto de 1575 – 21 de noviembre de 1582), Príncipe de Asturias.
- Felipe (14 de abril de 1578 – 31 de marzo de 1621), Príncipe de Asturias, futuro rey de España como Felipe III.
- María (14 de febrero de 1580 – 5 de agosto de 1583).
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| Isabel de Valois |
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| Ana de Austria |
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| Maria I de Inglaterra |
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| María Manuela de Portugal |
